设计出来的锌蛋白酶：一次设计 135 个，36% 切在指定的那根肽键上

2026 年 10 月 14 日，Nature 同日发表了蛋白质设计研究所的两篇酶设计论文，这是其中讲金属蛋白酶的一篇（s41586-026-11167-2，2025 年 10 月 14 日投稿，2026 年 9 月 15 日接收）。第一作者 Anqi Chen 与 Kejia Wu，通讯作者是苏黎世联邦理工的 Donald Hilvert 和华盛顿大学的 David Baker，共 28 位作者。本页所有数字读自作者提供的论文 PDF 正文与图注。本页转载的两张原图取自作者自存的预印本版本（bioRxiv 10.1101/2025.11.20.689622 第 4 版），因为正式版不能转载；两版的图号、面板与数值已逐一核对一致。作者已就相关方法与设计提交两份美国临时专利申请。^[S1][S2]

管线：把一个天然活性位点搬进新骨架，连底物一起设计

催化基序取自天然氨肽酶 N 与过渡态类似物的共晶结构（PDB 4QHP）：两个组氨酸和一个谷氨酸配位锌，另一个谷氨酸活化锌上的水去进攻羰基碳，一个酪氨酸稳定生成的氧负离子中间体。底物怎么摆，作者用 AlphaFold 3 预测天然 astacin 与底物肽的复合物，把底物以反平行 β 链的方式与酶配对，再把 P1-P2' 的坐标叠到催化残基上，凑成完整的目标活性位点。RFD2-MI（RoseTTAFold Diffusion 2 的分子界面微调版）围着这个位点生成 160-190 个氨基酸的骨架和 8-13 个残基的底物；序列由 LigandMPNN 的微调版 EnhancedMPNN 生成，并且是「两侧设计」：酶和底物的序列同时优化，所以每个蛋白酶都配着一条自己独有的底物序列。^[S2]

筛选环节是这篇论文真正的变量。每个设计用 AlphaFold 3 建三个状态：无底物的酶（看折叠）、酶-底物复合物（看底物位置）、过渡态类似物复合物（看过渡态稳定）。建酶-底物复合物时，第一种做法只放锌离子（SMILES `[Zn+2]`），这是预测锌结合位点的常规做法；第二种把催化必需的那个水也放进去（`[Zn+2].O`）。两种策略各送出 95 个和 40 个合成基因。结果差得非常远：只放锌的那批，89 个受测设计里 12 小时后有 14 个切掉 10% 以上底物（15%）；放了水的那批，38 个里有 35 个（88%）。135 个设计总体成功率 36%。回头看 Zn56（无活性）和 ZnO7（有活性），只放锌时两者的底物都摆得好好的，看不出差别；放了水之后，Zn56 的催化水把底物顶开了几埃，而 ZnO7 的待切键正对着进攻方向。^[S2]

活性先用「顺式」构型筛：把蛋白酶和它的底物连在同一条链上，后面接 mScarlet 做分子量指示，看 SDS-PAGE 上有没有切开。135 个融合蛋白里 131 个可溶、127 个跑在预期分子量。22 个命中又做了「反式」实验，蛋白酶和底物分开表达，14 个（来自五个不同骨架）在 37°C 一小时内切掉 10% 以上；两种格式的切割比例相关系数 0.91。^[S2]

变的是「能做什么反应」这条线，不是速率上限。肽键之所以是公认的难关，有三条具体原因，论文开篇就列了：酰胺的共振稳定让它比酯难断得多；蛋白里的胺离去基团很差，脱质子的 pKa 大于 35，而典型活化酯小于 8；肽底物柔性大，很难精确结合。此前的从头设计金属水解酶绕开了前两条：用活化酯。这篇把三条都正面接下来，代价是速率：刚出计算机的设计周转数比最好的天然蛋白酶低 3 到 4 个数量级。同时变的还有证据的质量：五个骨架都做了催化残基敲除，两个解了晶体结构，Foldseek 查下来对 PDB 里任何已知折叠的 TM-score 都低于 0.42，BLASTP 的 E 值在 0.34 到 33 之间：这些设计确实不是把天然蛋白换了几个残基。^[S2]

结合和切开是两类干预。此前被设计出来的蛋白绝大多数是结合蛋白：挡住一个界面、占住一个口袋，药效取决于能不能一直占着。切开不一样：一个蛋白酶分子可以处理很多底物分子（Zn45_v2 每个活性位点周转 3,500 次以上），而且被切开的东西不会恢复。论文选的三个靶都是聚集致病的蛋白：TDP-43（肌萎缩侧索硬化与额颞叶痴呆）、血清淀粉样蛋白 A、β 淀粉样蛋白。针对 TDP-43，作者刻意只切 C 端 320-350 这一段，目的是拆掉病理聚集体而保住这个蛋白本来的功能，这正是「长识别面」在治疗上的意义：不是把一个蛋白全清掉，而是只动它出问题的那一段。^[S2]

第二条用途更像工程。作者把一个此前设计的 IL-2 模拟物 Neo2 用一个小结合蛋白遮住受体结合面，中间的连接子里埋上 Zn45 的底物序列。不加蛋白酶时半数有效浓度约 0.5 nM，加 Zn45 或 Zn45_v2 后降到约 0.01 nM，与未遮蔽的 Neo2 相当，等于约 50 倍的激活窗口；而肿瘤里常被用作触发器的人源 MMP2 完全打不开它。同样的做法在一个被遮蔽的 EGFR 拮抗剂上也成立，催化残基敲除后失效。意义在于「正交」：这套开关用的是人体里不存在的蛋白酶，所以它什么时候打开，由给不给酶决定，而不是由病灶里恰好有多少 MMP2 决定。^[S2]

速率：和什么比，差多少。

两个蛋白酶-底物对做了稳态动力学。ZnO7 切自己的底物：kcat 0.0010±0.0001 s⁻¹，KM 4.9±1.2 μM，kcat/KM 210±60 M⁻¹s⁻¹。Zn45 切 ZnO36 的底物更快：kcat 0.025±0.002 s⁻¹，KM 26±5 μM，kcat/KM 900±200 M⁻¹s⁻¹，这个 kcat 相当于比无催化的肽键水解快 10^8 倍以上。随后作者把 Zn45 活性位点 4 Å 内的 21 个位置逐一换成除半胱氨酸外的每种氨基酸：11 个位置上原设计已是最优，另外 10 个换掉后活性至少提高 30%。合并其中四处（F48W、Y152I、A79Q、Y83Q）得到 Zn45_v2：kcat 0.75±0.04 s⁻¹，kcat/KM 31,000±5,000 M⁻¹s⁻¹，两项都比 Zn45 高 30 倍，相当于 1.4×10^10 倍加速，每个活性位点周转 3,500 次以上。需要分清的是：10^8 和 10^10 都是跟「水里自己慢慢水解」比，不是跟天然蛋白酶比。跟天然比的数字论文另外给了：刚出计算机的设计低 3 到 4 个数量级，Zn45_v2 把差距收到两个数量级。^[S2]

为什么还差这两个数量级。

这是论文里最有意思的一段自我检查：结构对得很准，并不等于催化好。机器学习力场算出的活化能垒，Zn45 和 ZnO7 分别比天然 astacin 高 3.6 和 15.1 kcal/mol；而 ZnO7 的晶体结构比 Zn45 更贴近设计模型，kcat 却更低。分子动力学给出了原因：Zn45 里催化谷氨酸 E77 的侧链在多个构象之间摇摆，取质子的那个氧和水上氢的距离起伏很大；Zn45_v2 和 astacin 里这个碱的构象稳定得多，平均距离分别是 1.75 Å 和 1.88 Å。待切肽键的朝向也一样：水氧-羰基碳-羰基氧的夹角在 Zn45 里平均 37.4°，Zn45_v2 是 99.4°，astacin 是 87.1°，后两者才接近亲核进攻的理想轨迹。所以差距的来源被定位成「预组织不够」：催化基团和底物都没被固定在该在的位置上。作者也明说，AF3 和 MPNN 都没能预测出这四个有益突变中的任何一个。^[S2]

选择性，以及它从哪里来。

因为酶和底物是一起设计的，每个蛋白酶都有一条独有的底物序列，这让交叉检验变得直接：七个蛋白酶对六条底物，结果五个骨架里四个优先切自己的那条。值得注意的是，设计过程中并没有做任何针对其他底物的负向设计，被预测会切别人的设计也没有被剔除：选择性是两侧设计自己带出来的。第五个设计 Zn45 是例外，它对测过的所有底物都有高活性，而这一点在设计时的 AF3 指标里就能看出来。蛋白酶与锌的解离常数在 10⁻¹⁰ 到 10⁻⁸ M 之间，ZnO39 到了亚纳摩尔级，高于此前报道的设计锌酶，接近一部分天然锌酶：这在不方便外加锌的治疗场景里是实际的好处。^[S2]

致病蛋白：做到哪一步为止。

针对 TDP-43 有两条路线。先改造已有的 ZnO36（部分扩散加重设计）得到 TDPr3，它能切目标序列，但仍更偏好原来的底物，作者归因于界面设计不够好。换成用原子级 RFdiffusion 直接为 TDP-43 肽段设计新骨架才成功：TDPn3 对目标序列的活性明显高于其他底物，kcat 0.033±0.003 s⁻¹，KM 52±9 μM，kcat/KM 640±130 M⁻¹s⁻¹。全长 TDP-43（单体与寡聚体）被切出预期大小的产物，质谱确认，只加缓冲液或用催化碱敲除体做对照都没有切割；但切全长比切合成底物慢，作者推测与 TDP-43 的液-液相分离或沉淀有关。血清淀粉样蛋白 A 的 SSRSFFSFLG 和 β 淀粉样蛋白的 KGAIIGLMVG 两段肽也各自设计成功。要说清楚的是，这一整节的实验对象都是体外的纯化蛋白和多肽，没有任何一步进入细胞内部或动物。^[S2]

筛选器就是假设，命中率就是检验

这篇论文最可迁移的一点，和同期 AlphaProtein Novo 那篇是同一个：筛选候选用的那个几何指标，本身就是一条可以被证伪的机理假设。这里的假设是「锌上那个待进攻的水会占掉空间，所以不建模它就看不出底物摆不摆得下」。检验方式是把两种建模各送一批去合成：15% 对 88%。这个对照的质量比大多数消融实验都高，因为它不是在同一批数据上回算，而是两批真实的湿实验。反过来说，这也提醒了一件事：此前那些「从头设计酶命中率只有百分之几」的结论，有多少其实是建模时漏了机理上必需的组分，而不是设计方法本身的上限，现在不好说。

同一天、同一个研究所的两篇

同日 Nature 还发了这个研究所另一篇从头设计蛋白酶的论文，走的是完全不同的化学：用活化的半胱氨酸而不是锌水解肽骨架，69 个设计里 13 个有效。两篇放在一起，说明的事情比任何一篇单独说明的都多：同一个难反应，两套互不依赖的催化方案在同一个月里都做成了，这比「某个方法奏效」更像是能力本身到位了。要注意的是两篇都出自同一个实验室体系，所以它们互为旁证而不是互为独立复现。